DNA限制性内切酶酶切是一项基于DNA限制性内切酶的基因工程技术，限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA。

我们常用的酶切体系推荐如下：

常用酶切体系参考

37℃，酶切1-2h

理论上质粒在多克隆位点处有片段插入时（插入片段中没有内切酶识别序列），双酶切后会出现一条带，但是在酶切实验中经常会出现切不开、切不对的情况，如下图所示。今天我们就来具体分析一下出现各种酶切结果的原因。

图一：构建了目的基因的质粒未完全酶切和完全酶切对比图

1.模板DNA不纯/质量不好

模板DNA制备过程中使用到乙醇、氯仿、苯酚、SDS、EDTA等，残留在DNA模板中，会不同程度影响酶的活性，可将DNA过柱纯化。PCR中参与扩增反应的DNA聚合酶具有外切酶活性，也可能会影响酶切产物末端完整性，进而影响克隆效率，建议使用PCR纯化后的产物。如果制备的质粒DNA质量不好（如细菌培养时间过长，质粒制备时裂解不充分或裂解时间过长等）也会影响到酶切结果，建议重新提取质量好的质粒进行酶切。

2.内切酶识别的DNA位点上的碱基被甲基化或存在其它修饰/酶不匹配

甲基化的DNA 可耐受部分限制性内切酶的切割，如果酶对甲基化敏感，还需要选择对甲基化不敏感的酶。双酶切A和B时，可设置预实验，A和B各自的单酶切和A+B的双酶切，好确认这几种酶合质粒上的酶切切点都可用。双酶切时一定不要选择产生同样黏性末端的不同酶，同尾酶会造成片段插入载体的方向不固定，插入方向错误会导致序列无法正常表达翻译。

3.取样不准

DNA溶液粘在管壁上，内切酶溶液粘度大，未取到所需量，建议加样时观察是否添加进行，加完各组分后用枪反复吸取混合，上机反应前进行快速离心。

4.反应条件/体系不合适

双/多酶切需选择各种限制酶均可发挥活性的酶切缓冲液。若双/多酶切的条件不同，分别进行两次酶切，切完一个纯化后再切另一个；温度要求不同，先酶切低温要求的，再酶切高温要求的；若盐浓度要求不同，先酶切低盐浓度要求的，再酶切高盐浓度要求的。酶应当是最后一个被加入到反应体系中（在加入酶之前所有的其它反应物都应当已经加好并已预混合）。若需要更精准的酶量，可根据每种酶的单位定义，精确计算出所需的限制性内切酶的量。简单的套用酶说明书中的“通用酶切方案“会导致很多酶切效果不佳。

5.酶失活

内切酶一旦拿出冰箱后应当立即置于冰上。如果限制性内切酶失活或部分失活，那么体系中的酶量就不能保证完全酶切。如果内切酶使用次数较多，可设置预实验验证单酶切，确保酶活性没有问题。

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